銘修生物實(shí)驗室--JC-1線(xiàn)粒體膜電位檢測試劑盒

1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit
JC-1線(xiàn)粒體膜電位檢測試劑盒
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱(chēng) 產(chǎn)品編號 規格 保存
JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit JC-1線(xiàn)
粒體膜電位檢測試劑盒
40S60 100 tests（6 孔板） -20℃避光保存
產(chǎn)品描述
JC-1 線(xiàn)粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit）是一種以JC-1 為熒光探針，快速靈
敏地檢測細胞、組織或純化的線(xiàn)粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細胞凋亡檢測，也是用來(lái)檢測細胞早期凋亡的常
用方法。
JC-1 是一種廣泛用于檢測線(xiàn)粒體膜電位△Ψm 的理想熒光探針，JC-1 染料以電勢依賴(lài)性的方式積聚在線(xiàn)粒體內。正常
線(xiàn)粒體內，JC-1 聚集在線(xiàn)粒體基質(zhì)中形成聚合物，聚合物發(fā)出強烈的紅色熒光（Ex=585 nm, Em=590 nm）；不健康的線(xiàn)粒體
由于膜電位的下降或喪失，JC-1 只能以單體的形式存在于胞漿中，產(chǎn)生綠色熒光（Ex=514 nm, Em=529 nm）。JC-1 不僅可用
于定性檢測，因顏色的變化可以非常直接的反映出線(xiàn)粒體膜電位的變化。也可以用于定量檢測，因線(xiàn)粒體的去極化程度可以
通過(guò)紅/綠熒光強度的比例來(lái)衡量。觀(guān)察時(shí)，只需使用常規的觀(guān)察紅色熒光和綠色熒光的設置即可。
線(xiàn)粒體膜電勢的破壞是細胞凋亡早期發(fā)生的一個(gè)標志性事件。細胞受到凋亡誘導后線(xiàn)粒體膜電位的變化使得膜的通透性
發(fā)生改變。膜通透性的增加，使得線(xiàn)粒體蛋白包括細胞色素C、Smac/DIABLO、HtrA2/OMI、核酸內切酶G（EndoG）、凋
亡誘導因子（AIF）等從線(xiàn)粒體基質(zhì)釋放到細胞漿。細胞色素C 的釋放伴隨膜電位的*喪失，進(jìn)而引發(fā)細胞凋亡酶的級聯(lián)
效應。
本試劑盒提供了CCCP 作為誘導線(xiàn)粒體膜電位下降的陽(yáng)性對照。對于六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測100 個(gè)樣
品；對于12 孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測200 個(gè)樣品。
試劑盒組分
編號 組分 規格 保存方法
40706-A JC-1(200×) 5× 100 μl/管 -20℃避光
40706-B JC-1 染色緩沖液（5×） 80 ml -20℃避光，也可4℃保存
40706-C CCCP（50 mM） 20 μl -20℃避光
40706-D 超純水 90 ml 4℃保存
運輸與保存方法
冰袋（wet ice）運輸。
-20℃避光保存，盡量避免反復凍融，有效期一年。超純水和JC-1 染色緩沖液（5×）也可4℃保存。
使用說(shuō)明
1. JC-1 染色工作液的配制
六孔板每孔所需 JC-1 染色工作液的量為1ml，其他培養器皿的JC-1 染色工作液的用量以此類(lèi)推；對于細胞懸液每50～100
萬(wàn)細胞需0.5mL JC-1 染色工作液。取適量JC-1（200×），按照每50μL JC-1（200×）加入8mL 超純水的比例稀釋JC-1。劇
烈震蕩充分溶解并混勻JC-1。然后再加入2mL JC-1 染色緩沖液（5×），混勻后即為JC-1 染色工作液。
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2. 陽(yáng)性對照的設置
把試劑盒中提供的CCCP（50mM）推薦按照1∶1000 的比例加入到細胞培養液中，稀釋至50μM，處理細胞20 分鐘。隨后
按照下述方法裝載JC-1，進(jìn)行線(xiàn)粒體膜電位的檢測。對于大多數細胞，通常50μM CCCP 處理20 分鐘后線(xiàn)粒體的膜電位會(huì )
*喪失，JC-1 染色后觀(guān)察應呈綠色熒光；而正常的細胞經(jīng)JC-1 染色后應顯示紅色熒光。對于特定的細胞，CCCP 的作
用濃度和作用時(shí)間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻資料決定或優(yōu)化體系摸索*條件。
3. 對于懸浮細胞
1） 取10～60 萬(wàn)細胞，重懸于0.5mL 細胞培養液中，細胞培養液中可以含血清和酚紅。
2） 加入0.5mL JC-1 染色工作液，顛倒數次混勻。細胞培養箱中37℃孵育20 分鐘。
3） 在孵育期間，按照每1mL JC-1 染色緩沖液（5×）加入4mL 蒸餾水的比例，配制適量的JC-1 染色緩沖液（1×），并放
置于冰浴。
4） 37℃孵育結束后，600×g 4℃離心3～4 分鐘，沉淀細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。
5） 用JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌2 次：加入1mL JC-1 染色緩沖液（1×）重懸細胞，600×g 4℃離心3～4 分鐘，沉淀細
胞，棄上清。再加入1mL JC-1 染色緩沖液（1×）重懸細胞，600×g 4℃離心3～4 分鐘，沉淀細胞，棄上清。
6） 再用適量JC-1 染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察，也可以用熒光分光光度計檢測或流
式細胞儀分析。
4. 對于貼壁細胞
對于貼壁細胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀檢測，可以先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的檢測方法。
1） 對于六孔板的一個(gè)孔，吸除培養液，根據具體實(shí)驗如有必要可以用PBS 或其它適當溶液洗滌細胞一次，加入1mL 細
胞培養液。細胞培養液中可以含有血清和酚紅。
2） 加入1mL JC-1 染色工作液，充分混勻。細胞培養箱中37℃孵育20 分鐘。
3） 在孵育期間，按照每1mL JC-1 染色緩沖液（5×）加入4mL 蒸餾水的比例，配制適量的JC-1 染色緩沖液（1×），并放
置于冰浴。
4） 37℃孵育結束后，吸除上清，用JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌2 次。
5） 加入2mL 細胞培養液，培養液中可以含有血清和酚紅。
6） 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察。
5. 對于純化的線(xiàn)粒體
1） 把配制好的JC-1 染色工作液再用JC-1 染色緩沖液（1×）稀釋5 倍。
2） 0.9mL 5 倍稀釋的JC-1 染色工作液中加入0.1mL 總蛋白量為10～100μg 純化的線(xiàn)粒體。
3） 用熒光分光光度計或熒光酶標儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進(jìn)行時(shí)間掃描（time scan），激發(fā)波長(cháng)為485nm，
發(fā)射波長(cháng)為590nm。如果使用熒光酶標儀，激發(fā)波長(cháng)不能設置為485nm 時(shí)，可以在475～520nm 范圍內設置激發(fā)波長(cháng)。另
外，也可以參考下面步驟6 中的波長(cháng)設置進(jìn)行熒光檢測。
4） 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察：方法同下面的步驟6。
6. 熒光觀(guān)測和結果分析
檢測 JC-1 單體時(shí)可以把激發(fā)光設置為490nm，發(fā)射光設置為530nm；
檢測JC-1 聚合物時(shí)，可以把激發(fā)光設置為525nm，發(fā)射光設置為590nm。
注意：此處測定熒光時(shí)不必把激發(fā)光和發(fā)射光設置在zui大激發(fā)波長(cháng)和zui大發(fā)射波長(cháng)。如使用熒光顯微鏡觀(guān)察，檢測JC-1 聚
合物時(shí)可使用常來(lái)檢測碘化丙啶或者Cy3 用的標準帶通濾波器。檢測JC-1 單體可使用常來(lái)檢測綠色熒光化合物如FITC 的
標準帶通濾波器。出現綠色熒光說(shuō)明線(xiàn)粒體膜電位下降，并且該細胞很可能處于細胞凋亡早期。出現紅色熒光說(shuō)明線(xiàn)粒體膜
電位比較正常，細胞的狀態(tài)也比較正常。

也可以使用雙帶帶通濾波器如FITC/羅丹明， FITC/Texas Red 來(lái)同時(shí)檢測兩種熒光探針。
另外，由于紅色的JC-1 信號淬滅比綠色快，所以用標準帶通濾波器檢測時(shí)先檢測紅色熒光并拍照。
注意事項
1） JC-1（200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì )凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可以20～25℃水浴溫育片刻至
全部融解后使用。
2） 必須先把JC-1（200×）用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后，才可以加入JC-1 染色緩沖液（5×）。不可先配制JC-1
染色緩沖液（1×）再加入JC-1（200×），這樣JC-1 會(huì )很難充分溶解，會(huì )嚴重影響后續的檢測。
3） 裝載完JC-1 后用JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌時(shí)，使JC-1 染色緩沖液（1×）保持4℃左右，此時(shí)的洗滌效果較好。
4） JC-1 探針裝載完并洗滌后盡量在30 分鐘內完成后續檢測。在檢測前需冰浴保存。
5） 請勿把JC-1 染色緩沖液（5×）全部配制成JC-1 染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過(guò)程中需直接使用JC-1 染色緩沖液（5×）。
6） 如果發(fā)現JC-1 染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進(jìn)溶解可以在37℃加熱。
7） CCCP 為線(xiàn)粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護。
8） 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。