細胞膜流動(dòng)性（fluidity）PDA熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

MX10362.1 v.A

  細胞膜流動(dòng)性（fluidity）PDA熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

  細胞膜流動(dòng)性（fluidity）PDA熒光檢測試劑是一種旨在通過(guò)苯并芘癸酸熒光染料，選擇性地與細胞膜整合，并與之產(chǎn)生空間交互作用，形成激基締合物，其熒光散發(fā)波長(cháng)的轉移，即熒光比值的增強或減弱，來(lái)分析膜流動(dòng)性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗證明的。其適用于各種人體或動(dòng)物貼壁或懸浮細胞膜流動(dòng)性的動(dòng)力學(xué)檢測。產(chǎn)品嚴格無(wú)菌，即到即用，活體檢測，操作簡(jiǎn)易，性能穩定。

技術(shù)背景

細胞膜和細胞質(zhì)微管以及微絲的動(dòng)力學(xué)特征和微泡和囊泡內脂質(zhì)的流動(dòng)動(dòng)力學(xué)，即流變學(xué)（rheological）細胞功能，受到細胞膜流動(dòng)性（fluidity）或粘性（viscosity）調節，包括細胞膜酶系的活化，微管和微絲的特定裝配或流動(dòng)，化學(xué)引誘物受體親和力的強化，膜結構和功能的作用等。一旦調節失衡，會(huì )導致病理演變或膜性變異。苯并芘癸酸（pyrenedecanoic acid；PDA）為多環(huán)芳香烴（polycyclic aromatic hydrocarbon）化合物，一種親脂性苯并芘熒光探針染料，用于膜生物物理學(xué)研究：一，具有親脂性； 第二，與細胞膜脂質(zhì)具有類(lèi)似性（analog），可以與細胞膜整合；第三，進(jìn)入膜結構空間后，與之產(chǎn)生交互作用，形成激基締合物（eximer），其熒光散發(fā)波長(cháng)由372nm轉移到470nm，通過(guò)締合物和單體的熒光比值（ratio），分析膜流動(dòng)性強弱，包括動(dòng)力學(xué)，影響因子等。  

產(chǎn)品內容

  染色液（Reagent A）            微升

  稀釋液（Reagent B）            毫升

  清理液（Reagent C）            毫升

  強化液（Reagent D）            微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)               1份

保存方式

保存  清理液（Reagent C）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；  染色液（Reagent A）避免光照；有效保證6月

用戶(hù)自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細胞脫離操作

細胞培養液（GMS12052）：用于細胞脫落操作

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺式離心機：用于樣品操作

培養箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光定性分析

比色皿或黑色96孔板：用于熒光定量分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于熒光定量分析

細胞流式儀：用于熒光分析

實(shí)驗步驟

實(shí)驗開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，  稀釋液（Reagent B）和  強化液（Reagent D）放進(jìn)25℃恒溫水槽里預熱。然后分別移出xx微升  染色液（Reagent A）和xx微升  強化液（Reagent D）到新的1.5毫升離心管，加入980微升  稀釋液（Reagent B），混勻后，在冰槽里靜置（共5次操作量），并標記為  染色工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

一、直接法

1． 準備1個(gè)96孔細胞培養板的待測細胞，每孔鋪滿(mǎn)率達70％（約1 X 10⁵細胞數）

2． 小心抽去細胞培養液

3． 輕輕沿著(zhù)孔壁加入xx微升   清理液（Reagent C）到細胞培養孔，覆蓋培養孔表面

4． 小心抽去  清理液（Reagent C）

5． 加入xx微升含有  染色液（Reagent A）、  稀釋液（Reagent B）和  強化液（Reagent D）的  染色工作液，覆蓋培養孔表面

6． 放進(jìn)25℃細胞培養箱里，孵育20分鐘（注意避光）

7． 小心抽去  染色工作液

8． 小心加入xx微升  清理液（Reagent C）

9． 小心抽去  清理液（Reagent C）

10． 重復實(shí)驗步驟8至9一次

11． 小心加入xx微升  清理液（Reagent C）

12． 選擇下列檢測：

一、 即刻在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察

1） 單體熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長(cháng)350nm，散發(fā)波長(cháng)370nm，干涉濾波器405nm波長(cháng) ）――可見(jiàn)淺藍色熒光；如果強度明顯，表明膜流動(dòng)性減弱

2） 激基締合物（eximer）熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長(cháng)350nm，散發(fā)波長(cháng)470nm）――可見(jiàn)深藍色熒光；如果強度顯著(zhù)減弱，表明膜流動(dòng)性減弱

二、即刻在熒光酶標儀檢測（激發(fā)波長(cháng)350nm，散發(fā)波長(cháng)370nm和470nm）：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU）以及RFU470/RFU370的比值：比值高，膜流動(dòng)性強

二、間接法

1． 準備1個(gè)12孔細胞培養板的待測細胞，每孔鋪滿(mǎn)率達70％（約2 X 10⁶細胞數）

2． 小心抽去細胞培養液

3． 加入xx毫升   清理液（Reagent C）到細胞培養孔，覆蓋培養孔表面

4． 小心抽去xx毫升   清理液（Reagent C）

5． 加入500微升用戶(hù)自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿(mǎn)整個(gè)培養孔表面

6． 置入37℃培養箱1分種

7． 輕輕抖動(dòng)培養板，使細胞脫落，然后加入1毫升用戶(hù)自備的細胞培養液

8． 移入1.5毫升離心管（注意：懸浮細胞從這一步開(kāi)始）

9． 放進(jìn)微型臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g

10． 小心抽去上清液

11． 加入xx微升含有  染色液（Reagent A）、  稀釋液（Reagent B）和  強化液（Reagent D）的  染色工作液

12． 用200微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細胞顆粒群

13． 放進(jìn)25℃細胞培養箱里，孵育20分鐘（注意避光）

14． 放進(jìn)微型臺式微型離心機離心5分鐘，速度為1000g

15． 小心抽去上清液

16． 加入xx微升  清理液（Reagent C），混勻細胞顆粒群

17． 放進(jìn)微型臺式微型離心機離心5分鐘，速度為1000g

18． 小心抽去上清液

19． 重復實(shí)驗步驟16至18一次

20． 加入xx微升  清理液（Reagent C），混勻細胞顆粒群

21． 進(jìn)行下列檢測

選擇一、（共聚焦）熒光顯微鏡觀(guān)察 

1． 混勻后，移出50微升在載玻片上

2． 即刻進(jìn)行載玻片壓片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察：

1） 單體熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長(cháng)350nm，散發(fā)波長(cháng)370nm，干涉濾波器405nm波長(cháng) ）――可見(jiàn)淺藍色熒光；如果強度明顯，表明膜流動(dòng)性減弱

2）激基締合物（eximer）熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長(cháng)350nm，散發(fā)波長(cháng)470nm）――可見(jiàn)深藍色熒光；如果強度顯著(zhù)減弱，表明膜流動(dòng)性減弱

選擇二、細胞流式儀分析

1. 混勻后，即刻進(jìn)行細胞流式儀分析：觀(guān)察5000個(gè)細胞以上

選擇三、熒光分光光度儀或熒光酶標儀測定

1． 混勻后，移出100微升到黑色96孔板里或100微升比色皿里

2． 即刻進(jìn)行熒光分光光度儀或熒光酶標儀測定（激發(fā)波長(cháng)350nm，散發(fā)波長(cháng)370nm和470nm）：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU）以及RFU470/RFU370的比值：比值高，膜流動(dòng)性強

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次（0.2毫升工作液）操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 待測細胞建議不要過(guò)于饑餓或過(guò)度生長(cháng)

4． 操作時(shí)，避免污染母液，尤其是  稀釋液（Reagent B）

5． 建議細胞染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測分析

6． 孵育時(shí)，避免光照

7． 本公司提供系列膜流動(dòng)性檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰