組織甘油-3-磷酸脫氫酶-II 活性比色法定量檢測試劑盒（中文版）

組織甘油-3-磷酸脫氫酶-II 活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）
主要用途
組織甘油-3-磷酸脫氫酶-II（Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase-II）活性比色法定量檢測試劑是
一種旨在使用合成電子受體染料，通過(guò)反應系統測定染料還原后峰值的變化，即采用比色法測算樣品中酶
活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗證明的。其適合于各種動(dòng)物、人體組織裂
解懸液樣品的甘油-3-磷酸脫氫酶-II 的性活性檢測?？捎糜谥?lèi)代謝、能量代謝等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋
白酶，嚴格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩定，反應優(yōu)化，檢測敏感。
技術(shù)背景
甘油-3-磷酸脫氫酶（Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase；GPDH），又稱(chēng)為α-甘油-3-磷酸脫氫酶（α-
glycerol-3-phosphate dehydrogenase；α-GPDH），催化糖酵解通路中產(chǎn)生的磷酸二羥丙酮（Dihydroxyacetone
phosphate）還原為sn-甘油-3-磷酸（sn-glycerol 3-phosphate）反應的酶，存在于在動(dòng)物、植物、酵母、細菌
中，尤其存在于人體的肌肉組織和脂肪細胞里。其功能在于參與甘油代謝，同時(shí)連接糖酵解和磷脂、甘油
三酯代謝通路在一起，完成脂類(lèi)和細胞壁的合成，以及能量供給、信號傳導、分解代謝和呼吸鏈電子傳遞
等作用。甘油-3-磷酸脫氫酶分為I型和II型：I型為胞漿型NAD依賴(lài)性甘油-3-磷酸脫氫（Cytoplasmic NAD+-
Dependent Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase或GPDH-NAD+ 2-oxidoreductase；EC1.1.1.8），II型為線(xiàn)粒體
型FAD依賴(lài)性甘油-3-磷酸脫氫（Mitochondrial FAD-Dependent Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase或acceptor
oxidoreduxtase；EC1.1.99.5）。I型和II型是聯(lián)合作用的：即I型通過(guò)NADH的氧化消耗，由磷酸二羥丙酮，獲
得sn-甘油-3-磷酸，后者通過(guò)線(xiàn)粒體外膜，進(jìn)入線(xiàn)粒體，受到II型的重新氧化為磷酸二羥丙酮，回到胞漿里，
同時(shí)產(chǎn)生ATP能量。其中II型是呼吸鏈電子傳遞的主要脫氫酶之一，在氧化甘油-3-磷酸的同時(shí)，還原輔酶黃
素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide；FAD）為還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（Reduced Flavin
Adenine Dinucleotide；FADH2），同時(shí)傳遞電子到泛醌（ubiquinone；UQ）分子，終傳遞到氧分子上?；?br />于底物甘油-3-磷酸，在輔酶黃素腺嘌呤二核苷酸的存在下，受到甘油-3-磷酸脫氫酶-II的催化，氧化產(chǎn)生磷
酸二羥丙酮，進(jìn)而通過(guò)使用人工電子受體染料二甲基噻唑二苯基四唑嗅藍（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-
2,5-diphenyl-tetrazolium bromide；MTT），簡(jiǎn)稱(chēng)噻唑鹽染料，接受來(lái)自還原型黃素腺嘌呤二核苷酸的電子，
而被還原，產(chǎn)生吸光峰值（570nm波長(cháng)）的變化，來(lái)測算甘油-3-磷酸脫氫酶II的活性。其反應方式為：
GPDH-II
glycerol-3-phosphate + FAD + 4H+ → Dihydroxyacetone phosphate + FADH2 + 2H+
Oxidized MTT/UQ + FADH2 → Reduced MTT/UQH2 + FAD + 2H＋
產(chǎn)品內容
裂解液（Reagent A） 毫升
強化液（Reagent B） 毫升
緩沖液（Reagent C） 毫升
反應液（Reagent D） 毫升
陰性液（Reagent E） 毫升
2
底物液（Reagent F） 毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6 月
用戶(hù)自備
1.5 毫升離心管：用于樣品保存的容器
15 毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
（微型）臺式離心機：用于樣品操作
比色皿：用于比色分析的容器
分光光度儀：用于比色分析
培養箱：用于孵育反應物
實(shí)驗步驟
實(shí)驗開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注
意避光。然后進(jìn)行下列操作。
一、 樣品準備
1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定100 毫克組織重量
2． 移入到一個(gè)液氮凍存管
3． 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
4． 次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
5． 放進(jìn)一個(gè)15 毫升錐形離心管
6． 加入預冷的X 毫升裂解液（Reagent A）
7． 渦旋震蕩5 秒，充分混勻
8． 在冰槽里孵育2 分鐘，期間渦旋震蕩5 秒一次
9． 加入X 微升預冷的強化液（Reagent B）
10．渦旋震蕩5 秒，充分混勻
11．在冰槽里孵育5 分鐘，期間渦旋震蕩5 秒二次
12．放進(jìn)4℃超速離心機離心10 分鐘，速度為10000g
13．小心抽去上清液
14．加入X 微升緩沖液（Reagent C），混勻線(xiàn)粒體顆粒群
15．移取10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意： Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－
30030.1 ）
16．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作
二、測定準備
1． 準備好待測樣品，置于冰槽里
3
2． 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(cháng)為570nm，間隔1 分鐘，讀數11 次（共10 分鐘），并置零
三、 背景對照測定
1． 移取X 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入X 微升反應液（Reagent D）
3． 加入X 微升底物液（Reagent F）
4． 放進(jìn)30℃培養箱里孵育5 分鐘
5． 加入X 微升陰性液（Reagent E）
6． 上下傾倒數次，混勻（限定在3 秒之內）
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照：570 波長(cháng)讀數10 分鐘 －570 波長(cháng)讀數0 分鐘
四、 樣品活性測定
1． 移取X 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入X 微升反應液（Reagent D）
3． 加入X 微升底物液（Reagent F）
4． 放進(jìn)30℃培養箱里孵育5 分鐘
5． 加入X 微升待測樣品（注意：100 微克線(xiàn)粒體蛋白）
6． 上下傾倒數次，混勻（限定在3 秒之內）
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品活性讀數：570 波長(cháng)讀數10 分鐘 －570 波長(cháng)讀數0 分鐘
五、 計算樣品活性
【（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數】÷【0.05（樣品容量；毫升）X 17（毫
摩爾吸光系數 X 10（反應時(shí)間；分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾MTT/分鐘
六、 酶標板測定
1． 在96 孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品
2． 分別移取X 微升緩沖液（Reagent C）到96 孔板中的所有孔中
3． 分別加入X 微升反應液（Reagent D）
4． 分別加入X 微升底物液（Reagent F）
5． 輕輕搖動(dòng)96 孔酶標板
6． 在30℃溫度下孵育5 分鐘
7． 分別加入X 微升陰性液（Reagent E）或待測樣品（50 微克線(xiàn)粒體蛋白）到相應孔中（注
意：樣品須清澈）
8． 輕輕搖動(dòng)酶標板
9． 即刻放進(jìn)酶標儀檢測：獲得吸光讀數
10．活性計算
[（樣品讀數－背景讀數）X 樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.0125（樣品容量；毫升）X 17（毫
4
摩爾吸光系數）X 0.6（厘米）X 10（分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾MTT/分鐘
注意事項
1． 本產(chǎn)品為21 次操作，包括1 次背景對照
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 系統操作過(guò)程中，背景測定只需1 次
4． 加入樣品后3 秒內即刻比色測定
5． 測定值由低到高變化；測定可以持續10 分鐘
6． 測定值由低到高變化，即10 分鐘測定讀數高于0 分鐘測定讀數，表明有酶活性
7． 比色測定后，比色皿須清洗*
8． 建議待測樣本蛋白濃度為100 微克/50 微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，則可以增加或降低樣本量；
注意計算公式的調整（本公司提供 Bradford蛋 白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1 ）
9． 甘油-3-磷酸脫氫酶-II 活性單位定義：在30℃溫度下，pH 7.4 條件下，每分鐘內能夠還原1 微摩爾二甲
基噻唑二苯基四唑嗅藍（MTT）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
10．本公司提供系列甘油-3-磷酸脫氫酶類(lèi)技術(shù)產(chǎn)品
質(zhì)量標準
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準確