細胞外泌體/微囊泡技術(shù)介紹

細胞外泌體/微囊泡介紹中文版，外泌體是細胞分泌的納米囊泡（EV），其直徑大小為30-150nm之間，具有閉合的脂質(zhì)雙分子層結構。 它幾乎存在于所有體液中，并在其表面以及胞內中攜帶各種分子（蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和RNA等物質(zhì)外泌體攜帶大量特異性的蛋白質(zhì)（如細胞因子、生長(cháng)因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物質(zhì)，在體內參與細胞通訊、細胞遷移、促血管新生和抗腫瘤免疫等生理過(guò)程，與多種疾病的發(fā)生和進(jìn)程密切相關(guān),由于外泌體的特殊結構和功能，使得它具有潛在的應用價(jià)值，一方面可以作為診斷多種疾病的生物指標，另一方面也可以作為治療手段，未來(lái)有可能作為藥物的天然載體用于臨床治療.

近年來(lái)，研究成果表明，外泌體循環(huán)微粒是促成心血管炎癥、堵塞與損傷的因素，而過(guò)往由于常規設備在微小顆粒檢測上的局限性，使循環(huán)微粒這一重要因素在過(guò)去往往被排出在病因分析之列。Apogee納米級超高分辨率流式細胞儀，*的100納米散射光分辨率及10nm的靈敏度，突破外泌體與微囊泡研究瓶頸，前沿科學(xué)研究大爆炸！

外泌體檢測

常規流式細胞儀小檢測細胞直徑200-500nm細胞，而檢測100-200nm或更小的顆粒時(shí)是無(wú)法實(shí)現。尤其在檢測細胞外囊泡、外泌體、微顆粒微小顆粒常規流式更是難以檢測到，本文章通過(guò)Apogee A50-Micro 超納米級流式細胞儀檢乳腺癌與健康人血液內外泌體免疫標記抗體表達量、培養細胞與血清內外泌體進(jìn)行對比。證實(shí)此款流式是目前檢測外囊泡的*能夠實(shí)現100納米級以?xún)褥`敏度的流式細胞儀。

通常情況下提取外泌體、微囊泡均為分離純化方法。如超速離心、免疫磁珠、超濾、沉淀或試劑盒等方法

圖A：通過(guò)差異離心速率獲得乳腺癌MDA-MB-231細胞和人血清中外泌體蛋白。 耗時(shí)3小時(shí)

圖B：通過(guò)使用試劑盒方法獲得外泌體分離，

圖C：通過(guò)NTA觀(guān)察，外泌體的平均大小為89±33nm，表面電荷為約30mV，

圖D E F：通過(guò)免疫印跡和免疫熒光染色方法分析CD63，CD81和LAMP2B存在，血清中分離外泌體Grp94的不表達情況。

實(shí)驗證明：傳統方法只能獲得廣泛性、某一類(lèi)別的外泌體、囊泡及雜質(zhì)物質(zhì)，無(wú)法針對性、性獲得到實(shí)驗目的蛋白，脂質(zhì)等。

培養細胞

圖A：Apogee A50- Micro*光散射器， 小角度光散射（SALS），中角光散射（MALS）和大角度光散射（LALS）檢測細胞內部顆粒，
圖D，E  F：Apogee Mix *微珠微珠作為內參，設置閾值。
圖G：設置樣本空白、同型對照可以觀(guān)察到MDA-MW-231 MCF-12A細胞外泌體樣本的、anti-CD44抗體表達情況。
圖H: 應用免疫印跡MDA-MW-231 與MCF-12A細胞對比CD44抗體，β-actin做內參。

實(shí)驗證明： 超納米級流式比免疫印跡方法學(xué)更、尤其對熒光較弱不會(huì )導致不可信數據。

乳腺癌監測

應用流式細胞儀與CD47 -ELISA方法學(xué)對比乳腺癌患者與健康人群中監測CD47表達量的動(dòng)態(tài)變化， 可以監測巨噬細胞摧毀癌細胞的能力。

A、C 圖：顯示健康人對照（A）乳腺癌患者（C）血液標本通過(guò)MALS 和LALS 散射光信號讀取的散點(diǎn)圖。
B、D圖： 顯示兩組樣本外泌體CD47表達異常，乳腺癌組CD47明顯表達減少，統計學(xué)差異P值=0.004說(shuō)明巨噬細胞啟動(dòng)吞噬效力。
E圖：在B、D圖個(gè)選取N=60人份血液標本。 未配對t檢驗，P值<0.05.
F圖：通過(guò)ELISA 測量健康人N=40人份，乳腺癌N=50份，CD47表達量，未配對t 檢驗，P值<0.01.

實(shí)驗證明：超納米級流式無(wú)法匹敵的散射光和分辨率可以檢測不同細胞領(lǐng)域，通過(guò)健康人與乳腺癌患者CD47抗體表達量的不同，可以判定癌癥療效和預后指標。

參