鈣離子膜通道鈉鈣交換體（NCX/內質(zhì)網(wǎng)）試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

鈣離子膜通道鈉鈣交換體（NCX/內質(zhì)網(wǎng)）功能熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

（中文版）

主要用途

 鈣離子膜通道鈉鈣交換體（NCX/內質(zhì)網(wǎng)）功能熒光檢測試劑是一種旨在使用選擇性?xún)荣|(zhì)網(wǎng)型鈣ATP酶、鈉鉀ATP酶和線(xiàn)粒體鈣泵抑制劑的條件下，通過(guò)鈣離子熒光探針，探測在A(yíng)TP的激發(fā)下，進(jìn)入內質(zhì)網(wǎng)內的鈣離子，而產(chǎn)生熒光增強，來(lái)分析和觀(guān)察內質(zhì)網(wǎng)鈉鈣交換體轉運功能的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗證明的。其適用于各種動(dòng)物、人體、真菌/酵母、植物等內質(zhì)網(wǎng)鈉鈣交換體活性的檢測，以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩定。

技術(shù)背景

鈉鈣交換體（sodium-calcium exchanger；Na⁺-Ca⁺⁺ exchanger；NCX）是一種反向協(xié)同膜蛋白（antiporter membrane protein），常見(jiàn)于興奮細胞的細胞膜上和線(xiàn)粒體或內置網(wǎng)上，使鈣離子排出胞漿外或進(jìn)入細胞器，通過(guò)移除1分子鈣離子，交換進(jìn)入3分子鈉離子，達到細胞鈣離子微環(huán)境穩態(tài)平衡，以控制神經(jīng)分泌、光敏受體活性、心肌松弛、以及興奮-收縮偶聯(lián)等功能。鈉鈣交換體和鈣ATP酶不同，其與鈣離子的親和力低。鈉鈣交換體有5種異構體：NCX1、NCX2、NCX3、NCX-SQ1、CALX。鈉鈣交換體異常與心肌缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury）有關(guān)。KB R7943、SEA0400和SN-6等是鈉鈣交換體選擇性抑制劑，具有治療心肌缺血、心律失常、心衰和高血壓的藥理價(jià)值。Mag-Fluo--AM染料是一種鈣離子低親和性的熒光標記染料，特異性地由內質(zhì)網(wǎng)捕獲，可以檢測內質(zhì)網(wǎng)內的游離鈣離子濃度的變化，進(jìn)而分析內質(zhì)網(wǎng)鈉鈣交換體的作用模式，監測鎂ATP誘導的鈣離子攝入，來(lái)評價(jià)鈉鈣交換體的功能。其基本檢測步驟是，首先引入熒光探針到內質(zhì)網(wǎng)，其次膜通透處理后，同步加入線(xiàn)粒體鈣泵抑制劑FCCP、內質(zhì)網(wǎng)型鈣ATP酶抑制劑毒胡蘿卜素（thapsigargin；TG）、鈉鉀ATP酶抑制劑烏本苷（ouabain）和Mg-ATP，在熒光分光光度儀下（激發(fā)波長(cháng)490nm，散發(fā)波長(cháng)525nm）觀(guān)察熒光峰值的變化。 

產(chǎn)品內容

 清理液（Reagent A） 100毫升

 染色液A（Reagent B1）  10毫升

 染色液B（Reagent B2） 100微升

 通透液（Reagent C） 200微升

 鈣化液（Reagent D）  20毫升

 攝鈣液（Reagent E） 100微升

 誘導液（Reagent F） 200微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)   1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融； 染色液B（Reagent B2）避免光照；有效保證6月

用戶(hù)自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（  12024）：用于細胞脫離

*細胞培養液（  12052）：用于細胞處理所需的培養基

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺式離心機：用于樣品操作

恒溫水槽或培養箱：用于反應孵育

100微升比色皿或黑色96孔板：用于熒光分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于熒光定量分析

實(shí)驗步驟

• 測定準備

• 開(kāi)啟并設定好熒光分光光度儀或熒光酶標儀（溫度為22℃）：激發(fā)波長(cháng)為490nm，散發(fā)波長(cháng)525nm，間隔30秒測讀1次，或動(dòng)態(tài)測讀，并置零
• 實(shí)驗開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置于室溫下凍融預熱，避免光照。然后進(jìn)行下列操作

• 熒光測定

• 間接法

• 準備1個(gè)25cm²細胞培養瓶的待測細胞，鋪滿(mǎn)率達70％（1 X 10⁶細胞數）
• 小心抽去細胞培養液
• 加入3毫升  清理液（Reagent A），覆蓋細胞表面
• 小心抽去 清理液（Reagent A） 
• 加入1毫升用戶(hù)自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿(mǎn)細胞表面
• 放進(jìn)37℃培養箱孵育1分種
• 輕輕抖動(dòng)培養瓶，使細胞脫落
• 加入3毫升用戶(hù)自備的*細胞培養液
• 移入到15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺式離心機離心5分鐘，速度為600g（注意：懸浮細胞可以從這一步開(kāi)始操作）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 染色液（Reagent B），混勻細胞顆粒群
• 加入5微升 染色液B（Reagent B2），混勻
• 室溫下孵育60分鐘，避免光照
• 放進(jìn)臺式離心機離心5分鐘，速度為600g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升 清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 轉移到1.5毫升離心管
• 加入10微升 通透液（Reagent C）
• 放進(jìn)37℃培養箱，孵育4分鐘（注意：這一步驟決定zui大內質(zhì)網(wǎng)鈣池濃度讀數；必要時(shí)可以調整孵育時(shí)間，既不能過(guò)長(cháng)，導致細胞死亡，又不能過(guò)短，導致通透不足）
• 放進(jìn)微型臺式離心機離心5分鐘，速度為600g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升 鈣化液（Reagent D），混勻細胞顆粒群
• 室溫下孵育5分鐘
• 放進(jìn)微型臺式離心機離心5分鐘，速度為600g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 分別移取100微升到5個(gè)100微升比色皿或黑色96孔板的4個(gè)孔，標記為背景、誘導鈣攝入、*鈣攝入、待測抑制劑
• 按下表分別加入

• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀或熒光酶標儀，動(dòng)態(tài)測讀3分鐘
• 獲得相對熒光讀數（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 分析結果

• （誘導鈣攝入RFU—背景RFU）：熒光差值越高，表明NCX轉運功能活性越強
• 【（誘導鈣攝入RFU—背景RFU）÷（*鈣攝入RFU—背景RFU）】X 100%=誘導鈣攝入百分率：百分率越高，表明NCX轉運功能活性越強
• 構建轉運曲線(xiàn)：縱座標（Y）為鈣攝入相對熒光單位（RFU），橫座標（X）為時(shí)間（秒）（注意：參見(jiàn)注意事項8）
• 構建抑制曲線(xiàn)：縱座標（Y）為熒光差值RFU，橫座標（X）為抑制劑濃度（微摩爾）
• 根據上述曲線(xiàn)，計算IC50（50％抑制率所需的抑制劑濃度）

二、 直接法

• 準備1個(gè)96孔細胞培養板中4個(gè)孔的待測細胞，鋪滿(mǎn)率達70％（5 X 10⁴細胞數/孔），分別標記為背景、誘導鈣攝入、*鈣攝入、待測抑制劑
• 小心抽去細胞培養液
• 小心加入200微升  清理液（Reagent A） 
• 小心抽去 清理液（Reagent A） 
• 小心加入100微升 染色液（Reagent B） 
• 小心加入1微升 染色液B（Reagent B2）
• 室溫下孵育60分鐘，避免光照
• 小心抽去染色液
• 加入200微升 清理液（Reagent A） 
• 加入2微升 通透液（Reagent C）
• 放進(jìn)37℃培養箱，孵育4分鐘（注意：這一步驟決定zui大內質(zhì)網(wǎng)鈣池濃度讀數；必要時(shí)可以調整孵育時(shí)間，既不能過(guò)長(cháng)，導致細胞死亡，又不能過(guò)短，導致通透不足）
• 小心抽去通透液
• 加入100微升 鈣化液（Reagent D） 
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去鈣化液
• 加入200微升 清理液（Reagent A） 
• 按下表分別加入

• 即刻放進(jìn)熒光酶標儀，動(dòng)態(tài)測讀3分鐘
• 獲得相對熒光讀數（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 分析結果
  • （誘導鈣攝入RFU—背景RFU）：熒光差值越高，表明NCX轉運功能活性越強
  • 【（誘導鈣攝入RFU—背景RFU）÷（*鈣攝入RFU—背景RFU）】X 100%=誘導鈣攝入百分率：百分率越高，表明NCX轉運功能活性越強
  • 構建轉運曲線(xiàn)：縱座標（Y）為鈣攝入相對熒光單位（RFU），橫座標（X）為時(shí)間（秒）（注意：參見(jiàn)注意事項8）
  • 構建抑制曲線(xiàn)：縱座標（Y）為熒光差值RFU，橫座標（X）為抑制劑濃度（微摩爾）
  • 根據上述曲線(xiàn)，計算IC50（50％抑制率所需的抑制劑濃度）

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 孵育時(shí)，避免光照
• 直接法，細胞換液時(shí)，避免使細胞脫落；如果細胞貼壁較松，建議使用間接法
• 可以進(jìn)行動(dòng)態(tài)或定時(shí)熒光檢測分析
• 用戶(hù)進(jìn)行抑制劑篩選，建議使用濃度梯度
• 可以使用NCX抑制劑毒BENZAMIL作為抑制劑對照
• 鈣離子轉運曲線(xiàn)參考圖像如下：

                                       ∣基礎∣   鈣攝入曲線(xiàn)  ∣

• 本公司提供系列鈣離子膜通道轉運功能（transport/uptake）分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰