細胞骨架（肌動(dòng)蛋白單體；G-ACTIN）紅色熒光染色試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

細胞骨架（肌動(dòng)蛋白單體；G-ACTIN）紅色熒光染色試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

（中文版）

主要用途

  細胞骨架（肌動(dòng)蛋白單體；G-ACTIN）紅色熒光染色試劑是一種旨在使用ALEXA染料標記的DNA酶I，探尋細胞骨架的肌動(dòng)蛋白單體的分布和局部定向變化狀況的典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗證明的。主要適用于各種活體細胞（動(dòng)物、人體、植物等）的細胞骨架裝配的檢測。產(chǎn)品嚴格無(wú)菌，即到即用，反應敏感，操作簡(jiǎn)捷，性能穩定。

技術(shù)背景

肌動(dòng)蛋白（actin）是42KD的球蛋白，構成細胞骨架的微絲（microfilament）和肌肉收縮裝置的細肌絲（thin filament），以及細胞膜表面偽足（pseudopodia）和微絨毛（microvilli）。肌動(dòng)蛋白存在于所有真核生物細胞中，且高度進(jìn)化保留，參與各種重要細胞功能，包括細胞遷移、細胞分裂、肌肉收縮、細胞形態(tài)維護、膜轉運（membrane trafficking） 等。哺乳動(dòng)物具有六種異構體，分成α、β、γ三類(lèi)。球狀肌動(dòng)蛋白（G-actin）在生理條件下，組合成長(cháng)絲聚合體，轉化為絲狀肌動(dòng)蛋白（F-actin），形成細胞骨架的微絲。肌動(dòng)蛋白的聚合與解聚的動(dòng)態(tài)學(xué)變化是細胞骨架裝配（cytoskeleton assembly）的主要參數之一。牛胰腺DNA酶I（DNase I）具有與肌動(dòng)蛋白單體（G-actin）高度親和力結合的特征，因此通過(guò)ALEXA染料標記的DNA酶I可以體外探測細胞G-肌動(dòng)蛋白的分布和含量，據此分析細胞骨架裝配的調控機制。

產(chǎn)品內容

  清理液（Reagent A）               毫升

  固著(zhù)液（Reagent B）             毫升

  通透液（Reagent C）             毫升

  染色液（Reagent D）           微升

  復染液（Reagent E）           微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)             1份

保存方式

保存   染色液（Reagent D）和   復染液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里，避免光照；有效保證3月

用戶(hù)自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細胞脫離

細胞培養液（GMS12052）：用于中和胰蛋白酶的處理

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于細胞染色的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

熒光（共聚焦）顯微鏡：用于細胞熒光觀(guān)察

實(shí)驗步驟

實(shí)驗開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下凍融。移取xx微升   通透液（Reagent C）到1.5毫升離心管，然后分別加入xx微升   染色液（Reagent D）和   復染液（Reagent E），混勻后，標記為   染色工作液，置于冰槽里，放進(jìn)暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。

一、 直接法

1． 準備1個(gè)細胞培養6孔板，內置1個(gè)細胞1 X 1 cm大小的載玻片

2． 接種待測細胞培養，直至每孔鋪滿(mǎn)率達70％

3． 小心抽去細胞培養液

4． 輕輕加上xx微升   清理液（Reagent A）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面

5． 小心抽去   清理液（Reagent A）

6． 輕輕加上xx微升   固著(zhù)液（Reagent B）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面

7． 室溫下孵育15分鐘

8． 小心抽去   固著(zhù)液（Reagent B）

9． 輕輕加上xx微升   通透液（Reagent C）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面

10． 室溫下孵育5分鐘

11． 小心抽去   通透液（Reagent C）

12． 輕輕加上xx微升   清理液（Reagent A）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面

13． 小心抽去   清理液（Reagent A）

14． 重復實(shí)驗步驟12和13二次

15． 小心加上xx微升   染色工作液， 覆蓋樣品表面

16． 在暗室里室溫下孵育20分鐘

17． 小心抽去   染色工作液

18． 輕輕加上xx微升   清理液（Reagent A）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面

19． 小心抽去   清理液（Reagent A）

20． 封片

21． 即刻在熒光（共聚焦）顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察（每個(gè)視野計數200個(gè)細胞）：激發(fā)波長(cháng)590nm，散發(fā)波長(cháng)617nm（G-肌動(dòng)蛋白染色）或激發(fā)波長(cháng)350nm，散發(fā)波長(cháng)460nm（細胞核染色）――

紅色熒光顯示G-肌動(dòng)蛋白；藍色熒光顯示細胞核為圓環(huán)或橢圓狀

二、 間接法

1． 準備1個(gè)25cm²細胞培養瓶的待測細胞，直至鋪滿(mǎn)率達70％（約100萬(wàn)細胞數）

2． 小心移出細胞培養液到15毫升錐形離心管（收集懸浮細胞）

3． 加入xx毫升   清理液（Reagent A），覆蓋細胞表面

4． 小心移出xx毫升   清理液（Reagent A）到15毫升錐形離心管

5． 加入1毫升用戶(hù)自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿(mǎn)細胞表面

6． 放進(jìn)37℃培養箱孵育1分種

7． 輕輕手擊震動(dòng)培養瓶，使細胞脫落

8． 加入3毫升用戶(hù)自備的細胞培養液

9． 移入到15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞可以由此步開(kāi)始）

10． 放進(jìn)臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

11． 小心抽去上清液

12． 加入xx微升   清理液（Reagent A），混勻

13． 轉入到1.5毫升離心管

14． 放進(jìn)微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）

15． 小心抽去上清液

16． 加入xx微升   固著(zhù)液（Reagent B），混勻

17． 室溫下孵育15分鐘

18． 放進(jìn)微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）

19． 小心抽去上清液

20． 加入xx微升   通透液（Reagent C），混勻

21． 室溫下孵育5分鐘

22． 放進(jìn)微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）

23． 小心抽去上清液

24． 加入xx微升   清理液（Reagent A），混勻

25． 放進(jìn)微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）

26． 小心抽去上清液

27． 重復實(shí)驗步驟24至26二次

28． 加入xx微升   染色工作液

29． 用200微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細胞顆粒群

30． 在暗室里室溫下孵育20分鐘

31． 放進(jìn)微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）

32． 小心抽去上清液

33． 加入xx微升   清理液（Reagent A），混勻

34． 放進(jìn)微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）

35． 小心抽去上清液

36． 加入xx微升   清理液（Reagent A），混勻

37． 即刻移取10微升在載玻片上壓片

38． 在熒光（共聚焦）顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察（每個(gè)視野計數200個(gè)細胞）：激發(fā)波長(cháng)590nm，散發(fā)波長(cháng)617nm（G-肌動(dòng)蛋白染色）或激發(fā)波長(cháng)350nm，散發(fā)波長(cháng)460nm（細胞核染色）――

紅色熒光顯示G-肌動(dòng)蛋白；藍色熒光顯示細胞核為圓環(huán)或橢圓狀

注意事項

1． 本產(chǎn)品為10次操作

2． 在整個(gè)操作過(guò)程中須戴手套，以防污染

3． 孵育時(shí)，必須避免光照

4． 建議檢測細胞量達10⁶細胞數為佳

5． 用戶(hù)可以根據情況，適度調整試劑用量

6． 建議細胞染色完成后，即刻進(jìn)行熒光分析，不宜超過(guò)1小時(shí)

7． 本公司提供系列細胞骨架檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰